تبلیغات

رتبه سنج گوگل

رتبه سنج گوگل

مقالات علوم دامی - بیماری آنفولانزای طیور (قسمت سوم)
 
مقالات علوم دامی

مقدمه :
شیوع ویروس آنفولانزای A,H5N1 در هنگ كنگ در سال 1997 ، 6 نفر از 18 نفری را كه عفونی شده بودند از بین بردواولین مورد مستند انتقال مستقیم ویروس آنفولانزای مرغی از طیور به انسان بود .
شیوع منجر به گسترش بیماریهای جدی كشنده شد وبعضی به آن بعنوان نخستین حالت پاندمیك اشاره می كنند .
كشتار تمام طیور در فروشگاههای فروش طیور زنده در هنگ كنگ در دسامبر 1997 باعث از بین رفتن منبع عفونت و جلوگیری از انتقال بیشتر به انسانها شد . ویروسهای H5N1 انسانی جداشده (/97 H5N1 ) تصور می شود كه بطور طبیعی از نوترتیبی ویروس های مرغی پدید آمده اند كه ژن ( HA ) هماگلوتینین بسیار با این ژن در ((A/goose/Guangdong/1/97(H5N1))) همولوگ می باشد وكمپلكس همانند ساز آن بمیزان زیادی با كمپلكس مانند ساز یروسهای (H9N2)A/guail/Hongkong/GI/97,(H6N1)Alteal/Hongkong/W312/97 مشابه می باشد .
ژن نورآمینیداز (NA ) ویروس H5N7/97 همچنین بطور نزدیك با این ژن در ویروس Alteal/Hongkong/W312/97 همولوگ می باشد .
در طول سالهای 1999 و2000 ویروسهای H5N1 شبهGO/Gd به خرچه زندگی خود در غازها درجنوب غربی چین ادامه دادند . این ویروسها با ویروسهای با منشاء مرغان آبی نوتركیبی داشتند وژنوتیپهای چندتایی ویروسهای H5N1 حاوی ژنهای NA,HA از ویروسهای شبه GO/Gd در فروشگاههای طیور هنگ كنگ بین فوریه وMay 2001 دوباره ظاهر شدند.
این ظهور دوباره ویروسهای H5N1 در پرندگان خاكی اولین بار بود كه بعد از اپیدمی دسامبر 1997 رخ می داد ومنتج به دومین میزان تلفات در طول 4 سال زندگی طیور درهنگ كنگ خصوصاً‌در ناحیه اجرائی گردید. تمام ویروسهای H5N1 جداشده از طیور در فروشگاههی خرده فروش طی زمستان وبهار 2001 نوتركیبهایی بودند كه حاوی ژنهای NA,HA در درمان GO/Gd وژنهای داخلی دیگر ویروسهای مرغان آبی بودند .
5 نوع از نوتركیب ها با ژنوتایپهای طراحی شده A,B,C,D,E مشاهده شدندد وبا توجه به منشأ فیلوژنی وساختار ژنهای داخلی گروه بندی شدند . ویروسهای تمام 50 ژنوتیپ شدیداً‌ برای جوجه ها وبلدرچین ها بیماریزا بودند همچنین تمام 5 ژنوتیپ برای موش هنگامی كه با دوزبالا باویروس عفونی تلقیح می شدند كشنده بودند . ویروسهای 4تااز 5 ژنوتیپ ازمغز موشهایی كه علائم اختلال سیستم عصبی مركزی CNS را داشتند جدا شد. پاتوژنیسته ویروس آنفولانزای A در موش معمولا نیاز به آداپته شدن با میزبان جدید ، كه طی رشد چند نسل پی درپی « پاساژهای پشت سرهم » ویروس در مغز یا ششها رخ می دهد .
مطالعه كسب بیماریزایی در طول آداپته شدن در موش نشان داد كه ویروسها آداپته شده با موش كه پنموویرولانس و نوروویرولانس هستند نشان داده كه با موتاسیون در NS,M,NA,NP,HA یك یا ده تا از ژنهای پلی مراز همراه می باشد .
برخلاف دیگر ویروسهای آنفولانزای A مرغی وانسانی ، سویه های مرغی و انسانی هنگ كنگ H5N1/97 جدا شده دارای پاتوژنیسته درموش می باشند بدون آداپته شدن . ویروسهای H5N1/97 در پاتوژنسیته برای موش هتروژنوس هستند : تعدادی از جداشده ها بسیار بیماریزا بودند و بصورت سیستمیك تكثیر می كردند درحالی كه دیگران دارای بیماریزایی كمتری بودند ودر دستگاه تنفسی تكثیر می كردند . پاتوژنز ویروسهای H5N1/97 درموش از دیگر ویروسهای شدید غیرپاتوژن H5 متمایز می باشد وشمای ملكولی فتوتیپهای H5N1/97 كه در موش بسیار پاتوژن هستند تعیین شده اند . بعلاوه ، Hatta وهمكارانش با استفاده از تكنیكهای معكوس ژنتیكی بر پایه پلاسمیدنشان دادند كه وجود یك لیزین در بنیان 627 در پروتئین PB2 ویك محل شكست پلی بازیك در HA برای بیماریزایی شدید و تكثیر سیستمیك ویروس (H5N1)A/Hongkong/483/97 درموش قطعی می باشد .
پاتوژسیته فتوتپهای كم و بسیار پاتوژن دریك مدل موش صحرائی عقیم مورد مطالعه قرار گرفته است : هر دوفتوتیپ شدیداً در موش صحرائی بیماریزا بودند بر خلاف بیماریزایی متفاوتی كه درموش دیده می شد .
پاتوژنسیته ویروس (H5N1 ) A/Hongkong/156/97 انسانی مورد مطالعه قرار گرفت . این ویروس بطور كارآمد در دستگاه تنفسی تكثیر می كند وقطعات ژنی بوسیله PCR درمغز وتعدادی ارگانهای داخلی عفونی شده تشخیص داده شدند اما هیچ گونه تكثیر سیتسمیك دراین ویروس مشاهده نشد .
درمطالعات فعلی ، ما از یك مدل موش برای تعیین خصوصیات پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1 2001 هنگ كنگ درمیزبانهای پستاندار استفاده كردیم . ویروسهای 4 ژنوتیپ از 5 ژنوتیپ بعد از تلقیح به داخل بینی از مغز موش جدا شدند . ما بیماریزایی را برای موش وشمای ملكولی این واریانت های نوروپاتیك موجود در مغز موش (MB) را با ویروس جدا شده با منشاء H5N1/01S را مقایسه كردیم نتایج دال بر تاثیر ژنهای داخلی بر روی پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 مرغی در میزبانهای پستاندار و احتمالاً انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن و نورویرولانت می باشد .
ویروسها :
ویروسهای 5 نوع H5N1 مرغی ، از هر 5ژنوتیپ كه در بهار سال 2001 در هنگ كنگ جدا شدند در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند. « شكل 1»
Genotype A,A/chicken/Hongkong/yu822.2/2001(ch/hk/yu822.2/01)
Genotype B,A/chicken/Hongkong/yu562/2001(ck/hk/yu562/01)
Genotype C,A/pheasant/Hongkong/Fyl55/2001(ph/HK/Fy155/01)
GenotypeE ,A/Chicen/Hongkong/NT87303/2001(CK/HK/NT87303/01).
ویروسها بوسیله یك پاساژ در جنین تخم مرغ جدا شدند . برای آماده سازی استوكها برای مطالعه درموش ، ویروسها قبلا برای یك بار بیشتر در حفره آلانتوئیك جنین 10 روزه جوجه برای 48تا40 ساعت در دمای c370 پاساژ داده شدند .
مایع آلانتوئیك حاوی ویروس خالص سازی شدند ومیزان عفونت زائی آنها در تخم
مرغ ها تیتر شد . تیترهای ویروس بعنوان log10 -50% از دوز عفونی كننده تخم مرغ در ml1/0 از مایع بیان می شد . (log10 50% EID50 per0.1 ml) با توجه به متد Reed , Muench . استوكهای ویروس به دو دسته زنده وتازه و دسته نگهداری شونده در 80- تا موقع مصرف تقسیم بندی شدند .
تمام مطالعات با ویروسهای H5N1 در سطح +3 ، Biosafty انجام گرفت آزمایشگاه توسط بخش كشاورزی ایالت متحده دراختیار محققین گذارده شد .
بیماری زائی وتمایل بافتی ویروس H5N1 اصلی جدا شده از موش :
موش ماده 5/1 ماهه BALB/C برای این مطالعات مورد استفاده قرار گرفتند . برای تعیین 50% دوز كشنده در موش ( MLD50) ، 4گروه ازموشها بوسیله استنشاق ایزوفلوران بیهوش شدندوبا ml 1/0 از مایع آلانتوئیك در سالین بافرفسفات بصورت تلقیح داخل بینی عفونی شدند (PBC ) « 10 رقت پشت سرهم از تا حیوانات روزانه وزن شدند و برای 20 روز تحت نظر گرفته شدند .
تیتراسیون MLD50 نشان داد كه تمامی 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1/01 از گروه دارای پاتوژنسیته كم در موش بودند به همین دلیل آنها بطور قابل توجه ای ایجاد بیماری ومرگ ومیر فقط در روز بالا ایجاد می شد .« جدول 1»
بدلیل اینكه ویروسها دارای ارزشهای EID50 مشابه بودند مارقت از مایع آلانتوئیك را كه حاوی تقریباً از ویروس به عنوان دوز عفونی برای مطالعات بیشتر بر روی پاتوژنسیته انتخاب شدند . گروههای 18 تا 26 موش ها با ml 501 از مایع آلانتوئیك رقیق شده با PBS بصورت داخل بینی مورد تلقیح قرار گرفتند .
3 موش از هر گروه در روزهای 3و7 بعد از تلقیح برای تعیین تیتر ویروس در ریه كشته شدند « روز 3 » ودر مغز و ارگانهای داخلی « روز 3و7» .
موش باقی مانده در هر گروه بصورت روزانه وزن شدند وبرای 20 روز تحت جهت مشاهده علائم بیماری ومرگ ومیر تحت نظر گرفته شدند .
شش ها ، مغز ، طحال ، كبد ، كلیه ، وقلب هر موش مرده یا حیواناتی كه مرحله پایانی بیماری كشته می شدند خارج شدند . ارگانها در PBS سرد شسته شدند ، وزن شدند، له شدند ودر PBS سرد با آنتی بیوتیكها برای به دست آوردن یك هموژن 10% هموژنیزه شدند . ناخالصی های نمك بوسیله سانتریفیوژ كردن درz,000 g برای 10 دقیقه ته نشین شدند .
بافت هموژن نشده به درون حفره آلانتوئیك جنین 10 روزه تخم مرغ تشخیص محدوده پائین تر ویروس 0.1log10 EID-DO/0.1ml از بافت هموژن می باشد .
3تا7 روز بعد از تلقیح هیچ ویروسی در مغز یا ارگانهای داخلی موش قابل تشخیص نبود. لیكن ویروس در مغز وارگانهای داخلی موش كه علائم نورولوژیك را نشان می داد 8تا10 روز بعد از تلقیح قابل تشخیص بود « بطور عمده فلج پای عقب »
نتایج بررسی پاتوژنسیته وبافت گرایی 5 ژنوتیپ H5N1/01 را به سه گروه تقسیم
می كند . گروه اول شامل ویروسهای ژنوتیپهای A,B هستند كه ابتدا در ریه های موش همانند سازی می كنند . عفونی شده با ویروس CK/HK/YU822.2/01 ، ویروس از شش ها ، مغز وارگانهای داخلی جدا شده ویروس به میزان كافی درمغز این حیوان همانند سازی كرده بود . تیتر ویروس CK/HK/YU822.2/01در كبد ، طحال وكلیه خیلی پائین بود .
« ویروس فقط از بافت هموژن رقیق نشده جدا شد .» ویروس ژنوتیپ B فقط در
شش های موش عفونی قابل تشخیص بود . عفونت با این ویروس باعث 55% مرگ ومیر گردید. گروه دوم متشكل از فقط یك عضو بود . ph/HK/FY155/01 ( ژنوتیپ c) ، كه در شش ها ومغز عفونی موش همانند سازی می كند .
عفونت با این ویروس منتج به بیشتر میزان مرگ ومیر گردید . این ویروس از مغزهای موش كه دارای فلج پیشرفتهای عقبی بود وتلف شده بود یا اینكه در روزهای 7تا10 بعد از تلقیح كشته شده بود جدا شد .29% از حیوانات تلف شده « 7/27 % از عفونی ها » دارای ویروس درمغز بودند .
ویروس ژنوتیپ c در شش ها ومغز موش با تیترمشابه ای ، كه حداكثر میزان را نسبت به بقیه ژنوتیپ ها داشت همانند سازی كردند.
گروه سوم ، شامل ویروسهای ژنوتیپ D,E كه همچنین در شش ها مغز موش عفونی تكثیر می كنند باشد اما بیشتر از ژنوتیپهای دیگر نوروتروپیك هستند ، تمام موشهایی كه بعد عفونی شدن بااین ویروسها مردند دارای ویروس در مغز بودند . نرخ مرگ ومیر موش عفونی شده با CK/HK/FY150/01 « ژنوتیپ D »
و CK/HK/NT873.3/01بترتیب 5/61% و 3/33% می باشند . موش های عفونی شده با ویروسهای ژنوتیپ E,D دچار فلج پای عقبی ، paresis , tremors قبل از مرگ در 10 تا 14 روز بعد از تلقیح می شدند .
پاتوژنسیته وتمایل بافتی واریانت های H5N1 جدا شده از مغز موش :
واریانت های نوروتروپیك ویروسهای اصلی ژنوتیپهای A,C,D,E « واریانت MB» از مغز بوسیله كشت مغز هموژن ویروس مثبت در تخم مرغ جنین دار 10 روزه با یك با پاساژ جدا سازی شدند .
ارزش EID50 , MLD50 همانطور كه در بالا شرح داده شد تعیین گردید . برای مطالعه پاتوژنسیته وتمایل بافتی ، گروههایی متشكل از 4 حیوان بصورت درون بینی با ml 1/0 از مایع آلانتوئیك رقیق شده باPBC حاوی تا از ویروس عفونی مورد تلقیح قرار گرفتند .
مغز ، شش ها و ارگانهای داخلی موش كه مرده بود یا در مرحله پایانی بیماری كشته شده بود خارج شدند .
واریانت های CK/HK/YU822.2/01 , MB, Ph/HK/FY155/01 –MB, CK/HK/FY150/01 –MB , CK/HK/NT87303/01 –MB طراحی شدند بطور قابل
توجه ای از ویروسهای اصلی بیماریزاتر بودند . این واریانت ها ارزش MLD50 مشابه با ارزش EID50 آنها داشت كه دلالت بر پاتوژنسیته بالای این ویروسها برای موش دارد . واریانت های MB با توجه به تمایل بافتی شان دریكی از دو گروه قرار می گیرند .
گروه اول شامل واریانت های با پاتوژنسیته بالا از ژنوتیپهای A,C می باشد كه بصورت سیستمتیك تكثیر پیدا می كنند و مغز وارگانهای داخلی را عفونی می سازند . دوزهای بسیار عفونی كننده از این واریانت های MB منتج به مرگ در روزهای 3و5 شده ،‌دوزهای پایین تر موشها را 6 تا 11 روز بعد از تلقیح می كشد . تلقیح با دوزهای تا از هر دو ویروس سبب ایجاد علائم نورولوژیك مانند فلج پاهای عقبی ، tremor , paresis گردید.
تیتر ویروس واریانت MB از ژنوتیپ های A,C در كبد و طحال وكلیه وقلب حداقل log102 تا 5/3 پایین تر از تیتر آنها در شش ها ومغز بود ، جایی كه واریانت ها بطور كافی همانند سازی می كنند . این نتیجه پیشنهاد می كند كه این واریانت ها ی MB پنموتروفیك ونوروتروفیك هستند .
گروه دوم شامل واریانت های MB از ژنوتیپ E,D هستند كه فقط در شش ها و مغز موش های عفونی تشخیص داده شده اند .
واریانت ژنوتیپ D موش را 4تا8 روز پس از تلقیح می کشدومیزان EID5025/1 10از وریروس عفونی باعث فلج پاهای عقب و Paresis در روزهشتم بعد از تلقیح می شود . واریانت MB از ژنوتیپ Dدر شش ها ومغز تمامی موشهای مرده یا كشته شده تشخیص داده شدند .
پاتوژنسیته CK/HK/NT873.3/01- MB « ژنوتیپ E» مشابه با واریانت ژنوتیپ D می باشد ، بیشتر حیوانات در روز نهم مردند وعلائم نورولوژیك درموش عفونی شده با دوزهای 25/3 10 و 25/2 10 و 25/1 10 EDI56 مشاهده شد . ویروس ژنوتیپ E از شش ومغز هر حیوان تلف شده یا كشته شده جدا شد . تیترهای واریانت های ژنوتیپ درشش ها ومغز مشابه بودند .
بررسی هیستوپاتولوژیك :
با تغییرات لوكالیزه پاتولوژیك در CNS باعث بروز علائم نورولوژیك می گردد ، نمونه های مغز وطناب نخاعی موش عفونی شده با CK/HK/YU822.2/02 – MB
« ژنوتیپ A» وموشهایی كه درمرحله پایانی بیماری از بین رفتند در بافرخنثی فرمالین 10% فیكس گردیدند ، درواكس پارافین تثبیت شدند ، برشهای 5 زده شدند ، با هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند و برای تغییرات هیستوپاتولوژیكال مورد ارزیابی قرار گرفتند.
دژنره شدن نرونها ونوروفاژیا با التهاب در اثر فیلتر نشدن گلرانولوسیتها وسلولهای مونونوكلوئر به ناحیه ساقه مغز و طناب نخاعی محدود می شد .
انفیلتراسیون سلولهای منونوكلوئر همچنین در مننژها و در فضاهای Prevascular ساقه مغز و neuropil طناب نخاعی دیده می شود .
در طناب نخاعی ، همچنین یك دژنره شدن معمول سلولهای گلیال را داریم ونرونهای با كروماتین های حاشیه ای ویك انكلوژن ائوزینوفیلیك كه به طور نسبی یا كاملا هسته را پر می كند . دژنراسیون نرونی و انفیلتراسیون التهابی همچنین در تعدادی از ریشه های dorsal گانگلیا مشاهده شد وتعداد زیادی از كانونهای نكروزه وسلولهای التهابی به همراه بافت تخریب شده مشاهده گردید.
مرفولوژی پلاك :
یكی از خصوصیات مهم ویروسهای آنفولانزا در توانایی تشكیل پلاك در سلولهای كشت داده شده می باشد . همانند پاتوژنسیته ، این خصوصیت می تواند طی انتخاب شدن در موش تغییر پیدا كند . مرفولوژی پلاك می تواند منعكس كننده هتروژنسیتی جمعیت ویروسی باشد . ارزیابی پلاك در سلولهای MDCK همانطوری كه در قبل شرح داده شد انجام می گیرد . ویروسهای با منشاء ژنوتیپ های A,B,C,D تشكیل پلاكهای بزرگ را كه بخوبی قابل تشخیص می باشد می دهند كه این از خصوصیات ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن می باشد . ویروس ژنوتیپ ( CK/HK/NT873.3/01 ) E پلاكهای كوچك و كدر را تشكیل می دهد.
پلاكهایی كه بوسیله ویروسهای با یك منشاء تشكیل می شود هموژنوس بودند . پلاكهایی كه بوسیله واریانت های MB تشكیل می شدند بزرگترازآنهایی بودند كه بوسیله منشاء تشكیل می شد و واریانت MB ژنوتیپ (CK/HK/NT873.3/01 – MB ) پلاكهایی را تشكیل می دهند نسبت به پلاكهای ویروس منشاء بهتر شناسایی شده است . هیچ پلاكی مانند آنهایی كه بوسیله واریانت های MB در سلولهای MDCKعفونی شده با ویروس های منشاء مشاهده می گردد تشكیل نمی شود .
افزایش مشابه دراندازه پلاك در واریانت های MB ژنوتیپهای C,D مشاهده گردید .
مقایسه توالی های ویروسهای منشأ و واریانت های MB
مطالعات در موش نشان می دهد كه تلقیح منشاء ویروسهای H5N1/01 جداسازی شده از ژنوتیپ های A,C,D,E درموش منتج به انتخاب واریانت های بسیار پاتوژن وعصب دوست می شود . با مقایسه تمام ملكول ایزوله های منشاء و واریانت های MB و تعیین اساس ملكولی بیماریزای در موش وتمایل به عصب ، تمام ژنهای پدید آورنده واریانت های MB تعیین توالی شدند .
RNA ویروسی از مایع آلانتوئیك حاوی ویروس با استفاده از RNeasyminikit جدا سازی شد . پرایمر uni-12 برای نسخه برداری معكوس مورد استفاده قرار گرفت .
PCR با دسته ای از پرایمرهای عمومی كه برای قطعات ژنی ویروسهای آنفولانزای A اختصاصی می باشد انجام شد . محصولات PCR با كیت خالص سازی سریع PCR (QIA ) خالص سازی شدند. عملیات تعیین توالی و بررسی نمونه ها درمركز بیوانفورماتیك وبیوتكنولوژی Harwell در بیمارستان تحقیقاتی كودكان St.Jvde انجام گرفت . تعیین توالی DNA كامل شد ، ویرایش شد ، ترجمه گردید وبا استفاده نرم افزار بررسی توالی به نام Lasergene بسته بندی گردید .
بررسی فیلوژنیك توالی های كل ژنوم از ژنهای واریانتهای MB H5N1/0 ، ویروس منشاء و CK/HK/YU562/01 ( ویروس ژنوتیپ B كه از مغز موش جدانشده بود) نشان داد كه ایزوله های منشاء دارای همان پراكندگی مشابه 5ژنوتیپی هستند همانطوری كه قبلاً براساس تعیین توالی نسبی توالی مشاهده شده بود .
واریانت های متمایل به عصب جدا شده از مغز موش متعلق به دسته مشابه ای از ژنوتیپها بود همانطوری كه در ابتدا درموش به طریقه داخل بینی تلقیح شده بود.
تغییرات توالی های آمینواسیدی بین ویروس های original و واریانت های MB آنها با آنهایی كه بین فنوتیپهای موش H5N1/97 انسانی با پاتوژسیته بالاوپایین یافت میگرد مقایسه گردید. تغییرات آمینواسیدی در واریانت های بسیار پاتوژن در تمام محصولات ژنی وجو داشت بجز پروتئین های NS1,NP,PB1 بیشترین تغییرات ویروسهای original رااز واریانت های MB متمایز می ساخت ، همانطور كه از دیگر ویروسهای با پاتوژنسیته بالاو پایین تمایز می ساخت وآنها منحصر به فردنبودند . طبیعت اتفاقی این تفاوتها پیشنهاد می گردد كه ویروسها هتروژنوس هستند ودلالت می كند براینكه احتمال انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن وجود دارد .
این پیشنهادات بوسیله هتروژنسیته توالی های original از ژنهای PA,PB2 تایید
می شود بخصوص در ژنوتیپ های A,C,D . واریانت MB از ژنوتیپ A(CK/HK/YU822.2/01 – MB ) از ویروس original بوسیله تغییرات منحصر به فرد در بنیان 738 در PB2 پلی مراز ، بنیان 10 و 212 در PA پلی مراز ، بنیان 50 در HA وبنیان 86 در NS2 وبوسیله حذف 20 آمینواسیدوجانشینی G به جای S70 در NA متمایز شدند . واریانت MB از ژنوتیپ C دارای 4 آمینو اسید منحصر به فرد بودند كه در موقعیت های 305 و 307 و 627 در PB2 ودر موقعیت 501 در PA در واریانت MB از ژنوتیپ D یك جانشینی منحصر به فرد در بنیان 97 در PA وجود دارد در حالیكه واریانت MB از ژنوتیپ E دارای چنین تغییراتی نبود . این موتاسیونهای منحصر به فرد ممكن است در اكتساب بیماریزای بالا و بیماری زای برای عصب در واریانت های MB دخیل باشند .
عدم وجود چنین تغییرات منحصر به فردی در واریانت MB از ژنوتیپ E می تواند در ابتدا بوسیله نوروتروپیسم بالا وبیماریزائی پایین ویروسهای original جدا شده از موش شرح داده شود. تغییرات متعاقب در واریانت MB ممكن است دارای اثر بیماریزائی داشته باشد ولی اثر نورویرولانس ندارد .
ویروسهای H5N1 هنگ كنگی مرغی وانسانی كه در سال 1997 جدا شده اند دارای ژنوتیپهای مشابهی هستند :
هتروژنیستی پاتوژنسیته آنها درموش نتیجه یك اختلاف كوچك در توالیهای ژنومهای ویروسی بود . در مقابل ویروسهای H5N1 جدا شده از فروشگاههای طیور هنگ كنگ ر سال 2001 از 5 ژنوتیپ مختلفی كه به طور طبیعی وجود داشتند بودند . این ویروسهای H5N1/97 و H5N1/01 به طور معمول فقط دارای ژن NA « كه از نظر فیلوژنیكی نزدیك به ویروسهای شبه GO/Gd می باشند » ویروسهای شبه GO/Gd كه در سال 1999 در هنگ كنگ جدا شدند. جدژنهای HA,NA وتعدادی از ژنهای درونی ویروسهای H5N1/01 بودند كه نشان داده شده دارای بیماریزایی كمی درموش بوده اند : این ویروسها به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كردند وفقط یكی از آنهایی كه جدا شدند ومورد مطالعه قرار گرفته اند به میزان خیلی كم درمغز ردیابی شده اند مافهمیدیم كه بیشتر ویروسهای H5N1/OS original همانند ویروسهای H5N1/99 شبه GO/Gd دارای پاتوژنسیته كمی در موش بودند وبه بافت عصب نیز تمایل داشتند . لیكن بر خلاف ویروسهای شبه GO/Gd ویروسهای H5N1/01 چها تار از 5 ژنوتیپ A-E در مغز موش قابل تشخیص بودند . زخمهای اختصاصی ویروس در ساقه مغز وطناب نخاعی وجراحات التهابی ریشه های بالایی گانگلیا دلالت می كند بر اینكه این واریانتهای MB نوروتروپیك از ششها به مغز به طریق انتقال سیناپسی بوسیله اعصاب حسی منتشر
می شوند . یك مسیر انتقال عصبی ویروس هم همچنین در موش عفونی شده با ویروسهای مرغی H5N3 كه درجوجه ها اداپته و بسیار بیماریزا شده بودند ، مشاهده شد . ویروس ژنوتیپB به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كنند و سبب مرگ ومیر می شوند . اما درمقابل ویروسهای ژنوتیپ A,C,D,E ویروس ژنوتیپ B از مغز جدا نشد . تلقیح موش با واریانتهای MB جدا شده از مغز نشان می دهد كه این واریانتهادر موش بسیار بیماریزا هستند وحداقل دارای بیماریزای مشابه در موش هستند همانطور كه ویروسهای H5N/97 با فتوتیب بسیار بیماریزا این كار را انجام می دهند . انتخاب واریانت نوروتروپیك از 5 ژنوتیپH5N1/01 طی تكثیر در موش سریع به وقوع می پیوندد واریانتهای MB بسیار پاتوژن فقط طی یك پاساژ ویروس تولید می شوند. چنین انتخاب سریعی احتمالاً بوسیله اقامت طولانی غیر معمول این ویروسها در ششها امكان پذیر
می گردد « ما این ویروس را از ششهای موش در روزهای 8 تا 12 بعد از تلقیح جدا كردیم . » یافته های ما دلالت می كند براینكه ارقام ژنهای داخلی در ویروسهی H5N1/97 كه از چرخه حیات بوسیله كشتار تمامی طیور در سال 1997 خارج شد .
فقط تركیب ژنها نبود كه منبع به پاتوژنسیته بالای این ویروس در طیور وپستاندران شد : قطعات مختلف چندتایی ژن داخلی ویروسها كه به طور رایج درجنوب شرقی چین درچرخه هستند می توانند كامل بكنند ژن HA ویروس شبه GO/Gd برای تولید ویروسهای كه بسیار بیماریزا هستند و در میزبان پستاندار خاصیت نوروتروپیك دارند. بنابراین HA ویروسهای شبه GO/Gd كه دارای سایتهای برش چندتایی هستند ممكن است یك نقش كلیدی را در بیماریزای ویروسهای مرغی H5N1 هنگ كنگی در گونه های پستاندران فقط هنگامی كه بوسیله یك تركیب مناسب با ژنهای داخلی كامل شوند ایفا كنند .
ویروس ژنوتیپ A ازنظر داشتن ژنهای PA,M از رده فیلوژنیك شبه GO/Gd با ژنوتیپ B متفاوت است. ژنوتیپهای C حاوی ژنهای NP,BP1 از ویروسهای شبه GO/Gd است كه این ژنها ژنوتیپ C را از ژنوتیپ A,B متمایز می سازد.
ژنوتیپ های D,E فقط در ژن NP شان با همدیگر وباژنوتیپ C فرق می كند ویروس ژنوتیپ B حاوی ژنهای HA,NA ای است كه از نظر فیلوژنی به ویروسهای شبه GO/Gd نزدیك می باشد این ژنها باعث می شوند كه این ویروسها در رده پرندگان وحشی دریایی ناشناخته باقی بمانند . ما پیشنهاد می كنیم كه جمعیت ویروسی ژنوتیپ B هموژنوس می باشد . چرا كه هیچ واریانت بسیار پاتوژنی از این ژنوتیپ طی یك پاساژ در موش انتخاب نمی شوند . ژن HA از ویروس ژنوتیپ B كه دارای سایتهای برش چندتایی كه از ویروسهای شبه GO/Gd منشاء گرفته اند به تنهایی كافی نیستند . تا معرف یك ویروس با بیماری زایی بالا و نوروتروپیسم در موش حداقل طی یك پاساژ باشد .
درمقابل جمعیت ویروس ژنوتیپ B جمعیتهای ویروسی ژنوتیپ های A,C,D,E هتروژنوس هستند چرا كه یك پاساژ از این ویروسها درموش منجر به انتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن می شوند . مقایسه توالی ها بین واریانتهای MB وفتوتیپ ویروسهای H5N1/97 هنگ كنگی كه برای موش بسیار پاتوژن هستند و ویروسهای اداتپه شد . با موش هیچ گونه از سریهای معمول موتاسیونها را نشان نمی دهد .
فقط جانشین K به جای E627 در PB2 در واریانت MB ژنوتیپ C كه مشاهده شده مشابه موتاسیون بود كه مسئول بیماریزایی بالایی ویروس HK/483/97 بود اما این موتاسیون فقط در ویروس ژنوتیپ C یافت می شد . فقدان یكسری موتاسیونهای رایج در واریانتهای بسیار پاتوژن و نوروتروپیك پیشنهادمی كندكه راههای مختلف زیادی برای ویروسهای آنفلونزای H5N1/01 هنگ كنگی برای دستیابی به بیماری بالاونوروتروپیسم در موش وجود دارد . شرط لازم برای نوروویرولانس ویروسهای H5N1/01 هنگ كنگی درموش وانتخاب سریع فنوتیپ های بسیار پاتوژن در میزبان جدید ممكن است به دلیل شكل گیری ویژه كمپلكس ژنهای همانندساز باشد .
محلهای برش چندتایی در HA ضروری می باشد . اما برای اینكه این ویروسها را بسیار پاتوژن ونوروویرلانت در موش باشد كافی نمی باشد ، تغییرات اختصاصی در پروتئینهایPA,PB2 پلی مراز در این فرایند دخیل هستند بنابراین ما حدس می زنیم كه انتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن نوروتروپیك طی نوترتیبی طبیعی بوسیله بالا رفتن هتروژنسیته ویروسی از اضافه شدن ژنهای PA « ژنوتیپ A و PB2 « ژنوتیپهای C,D,E» از منشاء شبه GO/Gd به زمینه كمپلكس همانند ساز از یك رده فیلوژنی دیگر تسهیل می شود . سوال در مورد ارتباط پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 هنگ كنگی در موش باتوانایشان در بیماریزای در انسان ودیگر گونه های پستانداران منطقی می باشد . لیكن انتخاب سریع واریانتهای نوروتروپیك درموش ارتباط نزدیكی با انتخاب سریع مشابه واریانتهای بیماریزا برای پستانداران دارد . تصمیم كشتار طیور در هنگ كنگ در سال 2001 یك راه مفید برای ریشه كنی این ویروسها وجلوگیری از انتخاب چنین واریانتهای بسیار پاتوژنی بود .
Accession توالیهای نوكلئوتیدی
توالیهای نوكلئوتیدی بدست آمده دراین مطالعه در ژن بانك تحت شماره از Accession
AY221592 تا AY221521 نگهداری می شود .
ارزیابی ویروسهای آنفولانزای H5N1 در اردكهای جنوب چین
خلاصه :
پاتوژنسیته ویروسهای آنفولانزا در پستاندران از اواسط دهه 1980 مورد ارزیابی قرار گرفت . دراینجا ، نشان می دهیم كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 ، كه از اردكهای به ظاهر سالم mainland چین از سال 1999 ، تا 2002 جدا شده اند ، بطور تصادفی پاتوژنسیته آنها برای پستانداران بالا رفته است ، وبطور فرضی مكانیسم این ارزیابی مستقیم را شرح می دهیم . 21 ویروس از اردكهای بظاهر سالم در جنوب چین از سال 1999تا 2002 جدا شدند كه تایید شد اینها تحت تیپهای ویروس آنفولانزای A , H5N1
می باشند . این ویروسهای جدا شده از نظر آنتی ژنتیكی به ویروس H5N1 A/GOOSE/Gvangdong/1/96 مشابه می باشند كه منبع ژن هماگلوتینین آنفولانزای پرندگان در هنگ كنگ در سال 1997 بود و تمامی آنها در جوجه ها بسیار بیماریزا بودند .
ویروسها به 4 پاتوتیپ بر اساس همانند سازی و قدرت كشندگی برای موش تقسیم بندی شدند . یك الگوی واضح در افزایش تصاعدی بیماریزای این ویروسهای جدا شده در مدل پستانداری وجوددارد . 5 تا از 6 H5N1 جدا شده در مرغابی هایی كه مورد تلقیح قرار گرفتند همانند سازی كردند وآنها از مجرای كلوآكه وتراكه ریزش ویروسی داشتند ولی هیچ كدام علائم بیماری را نشان نداند واز بین نرفتند . بررسی فیلوژنیك ژنوم كامل دلالت بر این امر دارد كه بیشتر ویروسهای نوترتیب حاوی ژن شبیه A/GOOSE/Guangdong/1/96 هماگلوتینین هستند و دیگر ژنها از ویروسهای ناشناخته روسی می باشد . این مطالعه بر روی تعین خصوصیات ویروسهای آنفولانزای H5N1 كه اخیراً‌ در میان اردكهای mainland چین در چرخش است متمركز می باشد . یافته های ما پیشنهاد می كند كه یك تلاش سریع و بلادرنگ برای جلوگیری از انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن از اردكهای به ظاهر سالم به جوجه ها یا میزبانهای پستانداری ضروری می باشد .
مواد وروشها
جدا سازی ویروس وشناسایی آن :
بعد از شناسایی ویروس A/Goose/Guang/1/96 (GSGD/1/96) (H5N1) بعنوان یك پیش ساز مهم ویروس آنفولانزای هنگ كنگی سال 1997 (HK/97) مراقبتهای روتین برای آنفولانزای مرغی توسط مسئولین در شهرهای Castol چین و استان های Guangdong , Guanxi,Fujian , Zhejiang , Shanghai شروع شد .
نمونه های كلوآك از اردكهای به ظاهر سالم مزارع گرفته شدند . ویروسها در جنین تخم مرغ همانطوری كه در رفرنس توضیح داده شده جداسازی شدند . تمام 21 ویروس H5N1 بوسیله تست های جلوگیری از هماگلوتیناسیون ( HI ) ونورآمینیداز « NI» با یك جدول آنتی سرمی كه بوسیله دفتر بین المللی آزمایشگاه رفرنس به نام Des Epizooties محدود در چنین اختصاصی _ بیماریزا وتخم مرغ آزاد بطور بیولوژیكی كلون گردید . تمامی آزمایشات با ویروسهای H5N1 جدا شده در یك سطح biosafety با امكانات 3 آزمایشگاه انجام گرفت وآزمایشات بر روی حیوانات در isolator های با هوای فیلتر شده وضریب كارآیی بالا ( HEPA – filtered ) انجام گرفت .
آزمایش حیوانات ، جوجه ها :برای تعیین پاتوژنسیته ویروسهای جدا شده شاخص بیماریزائی V 10 ( IVPI ) تست شد با توجه به دستور كار دفتر بین المللی DesEpizooties .
گروههای 10 تایی جوجه های سفید Leghorn ، 6 هفته واختصاصی و عاری از عوامل پاتوژن در قفس های جدا كننده نگهداری شدند وبا 2/0 ml از یك رقت 10/1 مایع آلانتوئیك عاری از باكتری وحاوی ویروس بصورت 10v مورد تلقیح قرار گرفتند
( تیترهای ویروسی در جدول شماره 1 نشان داده شده است )
10 جوجه اضافی بطریقه داخل بینی ( x10 ) با 6 10( eID50 ) egg 50% infeetive dose از هر ویروس در یك طیف 1/0 ml مورد تلقیح قرار گرفتند ، در روز سوم ، 3 تا از جوجه های هر گروه تلف شدند ومیزان ویروس در نمونه های شش ، bursa ، كلیه ، تیموس ، غده تیروئید ، مغز ، قلب ، پانکراس ، ماهیچه معده ، طحال وتراكه تعیین تیتر گردید . تست های مشابه بر روی پرندگانی كه تلف شده بودند انجام شد . این بافتها همچنین از نظر هیستوپاتولوژیكی مورد مطالعه قرا گرفتند ، آنهادر بافر خنثی محلول سیلین 10% فیكس شدند وبا هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند . نمونه های فیكس نشده برای عفونت زائی ویروس درجنین های تخم مرغ تیتر شدند .
موش : گروههای 8 تایی موش های ماده BALB 6 تا 8 هفته كمی با CO2 بیهوش شدند وبصورت n 10 با 0.610 ( CID50) از ویروسهای آنفولانزای H5N1 در یك طیف 50 ml مورد تلقیح قرار گرفتند.
موش كنترل با PBS تلقیح شد . در روز 3 ، سه تا از 8 موش را برای تیتر كردن میزان ویروس در شش ها ، كلیه ها ، طحال ، ومغز كشته شدن . دوز حداقل كه 50% موشها را می كشد ( MLD50 ) بوسیله متد Muench , Reed محاسبه شد .
اردكها : گروههای 5 تایی از اردكهای 3 هفته بطریقه x10 با 85.7 10 تا 5.8 10 ( eIO50 ) از ویروس آنفولانزا در 1/0 ml مورد تلقیح شدند . اردكها روزانه برای 10 روز از نظر بروز علائم بیماری تحت نظر گرفته شدند . نمونه های سوآپ كلوآك و oropharyngeal ازتمامی اردكها ، 3 و 5 روز بعد از تلقیح برای تیتراسیون ویروس در تخمها جمع آوری شدند .
بررسی ژنتیكی وفیلوژنیكی : RNA ویروسی از مایعات آلانتوئیك بوسیله استفاده كیت RNeasy , Mini خالص سازی شدند و نسخه برداری معكوس شدند . تكثیر با PCR بوسیله استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعات انجام گرفت . محصولات PCR با Kit خالص سازی QIA-quick PCR خالص سازی شدند و با استفاده از كیت Quick start – CEQDTCS بر روی یك DNA سكوانسر CEQ8000 تعیین توالی شدند . اطلاعات مربوط به توالی هابا برنامه SEQMAN نوشته شدند وتوالی های نوكلئوتیدی مقایسه شدند ودرخت فیلوژنیك با برنامه MEGALIGN با استفاده از الگوریتم مسیر GLSTAL ساخته شد .
شماره Accession توالی های نوكلئوتیدی : توالی های نوكلئوتیدی كه در این مطالعه به دست آمدند از ژن بانك با شماره :
( accession nos . AY585357 – AY85524 ) قابل دسترسی هستند .
نتایج :
بررسی آنتی ژنیكی : تستهای HI , NI با آنتی سرمهای رفرنس نشان داد كه هر یك از ویروسها تحت تیپهای H%N! می باشند . ویروسها دارای الگوی مشابه واكنش HI < NI هیچ گونه شواهدی دال بر دریفت آنتی ژنتیكی در ویروسهای جدا شده از 1999 تا 2002 وجود ندارد بعنوان مثال تیترهای هترولوگوس HI كمتر از 4 بود – تا خوردگی كمتر از تیترهای هترولوگوس HI بود .
مطالعات در جوجه ها : ما از IVPI وروش پیشنهادی دفتر بین المللی Des Epizooties برای ارزیابی بیماریزایی ویروس درجوجه ها استفاده كردیم .
تمام جداشده ها ، با این معیار بیماریزا بودند « جدول 1 » . لیكن یكی از آنها زودتر جدا شدند ( OKGX/07/99 ) فقط نیمی از جوجه هایی را كه به صورت V10تلقیح شده بودند كشتند. ومیانگین زمان مرگ (MDT) دو تا از جدا شده های اولیه 8 روز بعد ازر تلقیح به صورت x 10 بود . ویروسهای H5N1 جدا شد در سال 2000 تنوع در MDT
( 807 تا 303 ) بعد از تلقیح به صورت x 10 نشان دادند ، در حالی كه نمونه های جداشده در سالهای 2002 و2001 دارای MDT بین 7/1 و4 بعد از تلقیح x 10 بودند ( تنها استثناد DKGX/53/02 بود كه یك MDT بیش تر از 5/6 بود ) .یك تمایل به زیاد شدن افزایش در IVPA در وقت اضافی وجود دارد . در 7 تااز نمونه های جدا شده در 1999 و 2000 IVPA 3-9/2 بود. استثناء DKGX/53/02 بود كه IVPA آن 1/2 و MDT بیش تر از 5/6 روز داشت كه دال بر پاتوژنسیته خیلی كمتر می باشد ، تمام جوجه هایی كه در روز 2و3 بعد از تلقیح مردند دارای جراحاتی بودند كه دلالت بر همانند سازی سیستمیك ویروس می كرد . آنها دارای نكروز متوسط بافت مغز ، پنومونی شدید هیستوسایتیك همراه با ادم ، نكروز حادپانكراس ، نكروز خفیف طحال ، نفروزیس حاد یا ضعیف و نكروز خفیف تا حاد بورسابودند . فقط شواهد مربوط به DKGX/07/99 دال بر تكثیر غیر سیستمیك داشت .
مطالعات در موش :
بیشتر ویروسهای شدیداً پاتوژن آنفولانزای مرغی روسی جدا شده از سال 1997 قادر به تكثیر در پستانداران بودند . قبل از تست كردن بیماریزایی آنها در موش ، ما بطور بیولوژیكی هر ویروس جداشده را بوسیله 3 چرخه محدود رقت در جنین های جوجه اختصاصی – بیماریزا وبدون جنین كلون كردیم .
هیچ پاساژ كوری در موش انجام نشد . اطلاعات ما از یك پاساژ x 10 در موش به دست آمده اند .
بر اساس توانایی تكثیر وقدرت كم كردن وزن و ایجاد مرگ ومیر « جدول 2وشكل 1 » ، ویروسهای H5N1 جدا شده به چهار گروه تقسیم شدند . هنگامی كه ویروس از هیچ ارگان موش 3 روز بعد از تلقیح با 6 10eID50 جدا نشد وهیچ كاهش وزنی ومرگ ومیری درموش مشاهده نشد ویروس در موش غیر پاتوژن محسوب می شود . ویروسهایی كه می توانستند درموش تكثیر كنند بیشتر به گروههای پاتوژنسیته كم (LD506.5Log 10 eID50 M ) ، متوسط ( 3log10eID50 MLD50 6.5log10eID50 ) یا زیاد ( MLD 3log10eID50) ، بر اساس قدرت كشندگیشان در موش تقسیم بندی می شدند . گروههای غیر پاتوژن دارای 7 ویروس ( شامل GSGD/1/96) بودند كه در موش تكثیر نمی كردند وباعث كاهش وزن نیز نمی شدند ، فقط یك ویروس ( DKGX/22/01 ) موجب تغییرات سرمی می شدند . گروه كم پاتوژن حاوی 4 ویروس بود كه با تیتر نسبتاً پایینی در ششها تكثیر می كردند، تمام این موشها تا روز 14 بعد از تلقیح دچار تغییرات سرمی شده بودند .
یك دوز بالا از این ویروسها ( eID50 بیشتر از 5.6 10 ) برای كشتن موش مورد نیاز بود تمام 7 ویروس درگروه با بیماریزائی متوسط در ششهای موش تكثیر پیدا كردند . سطح پایینی از دو ویروس درطحال تشخیص داده شد ویكی از ویروسهای جدا شده (DKSH/8/01 ) در سطح خیلی پائینی در مغز یافت شد . تمامی این ویروسها سبب عفونت كشنده درموش شدند اما دوز بالای ویروس ( eID50 6 10 تا 4 10 ) و طیف MLD50( از 407 تا ( 604log10eID50 مورد نیاز بود .
4 ویروس بسیار پاتوژن با تیتر بالائی در ششهای موش تكثیر می یابند و وجود ویروس در طحال ، كلیه ومغز دال بر عفونت سیستمیك می باشد . MLD50 ویروسها در این گروه كمتر از (203log10eID50 ) بود .
ما یك افزایش سطح پاتوژنسیته برای موش را با پیشرفت زمان مشاهده كردیم :
ویروسهای جدا شده در سال 1999 و 2000 برای موش كمتر بیماریزا بودند نسبت به آنهایی كه در سال 2000 و2002 جدا شدند ، اگر چه یكی از ویروسهای جدا شده در سال 2000 ( DKGD/40/00 ) در گروه با بیماریزائی متوسط قرار داشت ویكی از ویروسهای جدا شده درسال 2002 ( DKGX/53/02 ) دارای بیماریزایی كم بود
مطالعات در اردكها :
اردكهای وحشی میزبان طبیعی ویروسهای آنفولانزا هستند . تمام تحت تیپهای آنفولانزای مرغی از اردكهای وحشی جدا شده اند وهیچ یك از آنها كه شامل تحت تیپهای بسیار پاتوژن H5,H7 نیز می باشند وهیچ سابقه تاریخی دال بر ایجاد بروز علائم یا مرگ در اردكها ندارند .
بطور غیر منتظره ، ویروسهای H5N1 جدا شده از مرغابی های وحشی در هنگ كنگ در نوامبر 2002 سبب بیماری شدید عصبی شد واردكها را هم درمزرعه وهم در آزمایشگاه كشت . ما گروههای 5 تایی اردكها را با 6 ویروس H5N1 كه نماینده ویروسهای مطالعه شده در این تحقیق می باشند شامل 3 ویروس از زیر گروه بسیار پاتوژن درموش تلقیح كردیم . « جدول 3 ». 5 تا از 6 ویروس H5N1 جدا شده در مرغابی هاهمانند سازی كردند . آنها دارای ریزش ویروسی از تراكه یا كلوآك در سطح 2.0-403log10eID50/ml بودند . ویروسها در اثر تماس پرندگان در ایزولاتور منتقل نشدند وهیچ یك از ویروسها سبب بروز علائم بیماری یا مرگ در اردكها نشد . جدول 3
بررسی ملكولی وفیلوژنتیكی : برای تعین اساس ملكولی مشاهداتمان ، تمامی ژنوم هریك از 21 ویروس جدا شده تعیین توالی شدند. توالی ها با توالی های نماینده H5N1 شامل آنهایی كه از GSGD/1/96 وانواع انسانی جدا شده از هنگ كنگ در سال 1997 HK/156/97 , HK/483/97 , HK/486/97 به دست آمده از بانك ژنی مقایسه شدند .توالی های هماگلوتینین HA ونورآمیند از NA مربوط به ویروس A/duck/Anyang/av – 1/01(H5N1) ( DK/AY/01 ) جدا شده از گوشت اردكهای صادراتی از چین به جنوب كره نیز مورد بررسی فیلوژنیكی قرار گرفتند . شكل 2
ژنهای NA ویروسهای H5N1 جدا شده از ویروسها بیشتر به ژنهای (GSGD/1/96 96.4-9803% همولوژی ) نزدیك بودند تا ویروسهای جدا شده HK/97 ازیك شاخه جداگانه با NA هایی می باشد كه ما از اردكها جدا كردیم . NA های ویروسهای جدا شده از اردكها به دو چنگال تقسیم می شدند كه DKGX/07/99 پایه وستون چنگال GSGD/1/96 , B1 پایه چنگال B2 می باشد . هر یك از این چنگالها حاوی ویروسهای جدا شده از 2000 تا 2002 می باشد. DK/AY/01 در چنگال از GSGD/1/96 مشتق می شود . بررسی توالی های آمینواسیدی بدست آمده نشان می دهد كه تمامی ویروسهای درچنگال كه از GSGD/1/96 مشتق می شوند دارای یك حذف 20 آمینواسیدی در ساقه NA هستند ( بنیان 49 تا 68 ) ، در حالی كه خود GSGD/1/96 این طور نیست . این حذف درساقه NA ، دارای فاصله اما هم پوشانی با حذف 19 آمینواسیدی یافت شد در ویروسهای HK/97 جدا شده از انسانها می باشد . ( بنیان های 54-72 ) . هیچ حذفی در ویروسهای NA در چنگال مشتق شده از DKGX/07/00 وجود ندارد.
درخت فیلوژی ژنهای PA,PB1,PB2 از 22 ویروس H5N1 خیلی شبیه بودند .
« شكل 2 ،‌c_e » . ویروسهای انسانی HK/97 جدا شده از یك شاخه مجزا بودند ، در حالی كه ویروسهای جدا شده از اردكها و GSGD/1/96 به دو چنگال اصلی كه در آن ویروسهایی كه جلوتر جداشده اند بطور غالب در یك شاخه هستند تقسیم بندی می شوند . در درخت فیلوژنی PB2 ، ژنهای دوچنگال در شاخه B سهم زیادی از همولوژی راداشتند ومتعلق به یك دودمان می باشند.
به بیان دیگر، چنگالهای B1,B2 ژنهای PB1.PA دارای 93-90% همولوژی بودند ومی توان آنها را به عنوان دودمان متفاوتی در نظر گرفت .
درخت فیلوژنیك «NP » نوكلئوپروتئین « شكل f 2 » متفاوت بود : ژنهای NP از 3 ویروس جدا شده از اردكها ( DKSH/35/02 , DKSH/38/01 , DKGX/50/01 ) یك شاخه جدا گانه را تشكیل می دهند ، درحالی كه HK/97 t NP انسانی یك چنگال را تشكیل می دهد ودیگر H5N1 های جدا شده چنگالهای چندتایی خواهر را كه با زمان یا محل جغرافیشان مطابقت نمی كند تشكیل می دهند . درخت فیلوژنیك M« ماتریكس » ژن دقیقاً مشابه با درخت ژنهای پلی مراز بود ، اما M ژنهای DKGD/40/00 , DKFJ/19/00 درچنگال متفاوتی در شاخه B كه خودش به باقی مانده ها ، شامل ویروسهای انسانی HK/97در آلل B مجزا می شدند «شكل 2-h » .
4 ویروس اردكی و GSGD/1/96 در آلل A قرار داشتند ، در حالی كه باقی مانده ها ، شامل ویروسهای انسانی hk/97كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند . در آلل B كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند . توالی های آمینواسیدی بدست آمده از تمام ویروسها درچنگال B1 از شاخه B درالل B دارای یك حذف 15-nt می باشد كه منجر به یك حذف 5 آمینو اسیدی در NS پروتئین می شود . «موقعیت 80 تا 84 » بر اساس تنوع ژنومیكی ، ویروسها 9 ژنوتیپ را تشكیل می دهند كه تكامل و ارتباطات درشكل 3 نشان داده شده است .
این مسئله كه ژنهای مشابه PB2,HA,NA در ژنوتیپ های متفاوت یافت می شوند قابل ملاحظه می باشد. اتصال وارتباط قوی بین ژنوتیپ ویافنوتیپ این ویروسها درموش وجود ندارد ، درحالی كه مسیرواضح از افزایش تصاعدی بیماریزایی این ویروسها در میان ژنوتیپهای مشابه ، بخصوص ویروسهای ژنوتیپ A,D دیده می شود .
DHSH/35/02 ,DKSH/38/01 در ژنوتیپ مشابه قرار دارند . « F » ، اما DKSH/35/02 3 10 بار كشنده تر از DKSH/38/01 در موش می باشد . بیماریزایی متفاوت دو ویروس در ژنوتیپهای گروهی H,I بیشتر از به ترتیب 105X ,106 X می باشد . این نتایج پیشنهاد می كند كه موتاسیونهای بخصوص بیشتر از ساختار ژنومی ممكن است قدرت بیماریزایی آنها را تعیین سازد . شكل 3
بحث :
این مطالعه شرح می دهد كه قبلاً جدا سازی ویروسهای آنفولانزای H5N1 تعیین خصوصیت نشده از اردكهای منطقه mainland چین از GSGD/1/96(H5N1) گزارش
شده اند. یافته های ما نشان می دهند كه ویروسهای آنفولانزای بسیار بیماریزا از اردكهای به ظاهر سالم در استان Coastal چین ( بین Shanghai , Guandong ) از سال 1999 تا 2002 جدا شدند . این ویروس H5N1 جدا شده واكنش آنتی سرمی مشابه داشتند وژنهای HA آنها از نظر فیلوژنیكی هموژنوس بود . تمامی آنها به جز یكی سبب عفونت كشنده و وسیع سیستماتیك در جوجه ها می شدند و همگی دارای یك ردیف هایی از آمینواسیدهای پایه در محل برش HA بودند كه با بیماریزائی بالا همراه بود.
یافته های ما مشخص كرد كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 درمیان اردكهای اهلی در چین از 1999 تا 2002 كه درچرخش هستند قادر به تكثیر در موش بوده و سبب عفونت سیستماتیك ومرگ بدون سازگار شدن در موش می شوند .
تعدادی از محققین گزارش كرده اند كه ویروسهای H5N1 جدا شده از انسان برای موش كشنده هستند .
فاكتورهایی زیادی گزارش شده اند كه با بیماریزائی H5N1 همراه می باشند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده كه بنیان 627 پروتئین PB2 یك نقش حیاتی در بیماریزائی H5N1 در موش دارد ، همانطور كه داشتن ردیفهایی از آمینو اسیدهای اساسی در محل برش HA همین نقش را دارد . مطالعات دیگر نقش ژن NSوتوانائیش درتعدیل پاسخ سیتوكاینی را بازگو می كند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده اند كه بان 92 از ملكول NS1 از نمونه های ویروسهای (H5N1) A/HK/156/97 انسانی با القاء بیماریزائی شدید در خوكها همراه می باشد. لیكن ، تمامی ویروسهای H5N1 اردكی دارای بنیان های آمینو اسیدی حفاظت شده GLV-627 در PB2,ASP-92,GLY-228 ( اعضای H3) در محل باند شدن بارسپتور می باشند . بنابراین ، این بنیانها ممكن است كه در همانند سازی های متفاوت وبیماریزائی ویروسهای H5N1 اردكی در موش شركت نكنند . سوال مهمی كه باقی می ماند این است كه چگونه و چه وقت ویروسهای H5N1 توانایی تكثیر پستانداران را پیدا كردند .
نتایج ما نشان می دهد كه همانطور كه ویروسهای H5N1 در میان اردكهای اهلی در چرخش هستند ، خصوصیاتی درانها پدید می آید كه می توانند برای موش كشنده باشند. یك شرح احتمالی برای این یافته ها انتقال ویروسهای H5N1 از اردك به انسانها ، تكامل انتخابی ویروسها در انسان ها ومتعاقباً انتقال دوباره آنها به اردك می باشد . شواهد محدود سرولوژیكی از عفونت زایی H5N1 انسانی وجود دارد همچنین شواهد محدودی نیز درباره انتقال فرد به فرد ویروسهای H5N1 وجود دارد . شواهد در دسترس پیشنهاد می كند كه از سال 1997 ، ویروسهای آنفولانزای آسیایی باعث عفونتهای محدود كشنده یا حاد در انسانها می شوند ، اما از انسان به انسان منتقل نمی شوند . انتقال بازگشتی ویروسها را از انسانها به اردكها را به سختی می توان اثبات كرد ، علی رغم وجود شواهدی كه در مورد انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی H9N2 از اردكها به دیگر طیور و سپس برگشت آنها به اردكها وجود دارد.
مسئله اساس ملكولی ویروسهای قابل انتقال به پستانداران حل نشده است . بطورعمده ژنهای چندتایی ویروسی ، شامل HA دخیل هستند . تعدادی ساختارهای ژنهای مرغی چنین فرض می شود كه باعث انتقال به پستانداران می شوند. ویروسهای آنفولانزای H3N2كه درخوكها در سال 1997 در ایالت متحده وجود داشته اند نوترتیبهای 3 تایی بودند كه حاوی قطعات ژنی از ویروسهای آنفولانزای مرغی ، انسانی وخوكی بودند. این ویروسهای نوترتیب 3تایی H3N2 درمیان خوكها به میزان بسیار بالایی منتقل می شوند و در ایالت متحده انتشار وسیعی پیدا كردند .
به طور مشابه ، ویروسهای آنفولانزای خوكی H1N1 كه بطور رایج در اروپا دارای انتشار وسیع هستند حاوی ژنهای ویروسهای آنفولانزای مرغی كه در سال 1999 یافت شدند می باشند . در نتیجه ، ژنهای ویروس آنفولانزای مرغی ، وقتی كه آنها قسمت عمده ای از ساختار ژنی باشند ، به نظر می رسد كه بتوانند در میان گونه های پستانداران منتقل شوند . ارزیابی ژنوتیپهای مختلف ویروسهای H5N1 در اردكها ممكن است ساختار ژنهایی را كه سبب انتقال به پستانداران می شوند روشن سازد . احتمالات متفاوتی در مورد انتخاب خوك بعنوان میزبان وجود دارد .« وجود یك میزبان واسط » . در ناحیه ای از چین كه ویروسهای H5N1 آنها در این مطالعه تعیین خصوصیت شدند ، خوكها واردكها در كنار یكدیگر نگهداری می شوند خصوصاً در مزارع روستایی كه خانواده ها دارای تعداد كمی خوك واردك هستند . فرضیه كار ما این است كه ویروسهای H5N1 بتدریج توانایی تكثیر در پستانداران را از طریق انتخابی كه تحت فشار رخ می دهد وهمچنین احتمال انتقال بین خوكها واردكها پیدا می كنند . امروزه ، هیچ گزارشی از جداسازی ویروسهای H5N1 از خوكها وجود ندارد ، اگر چه خوكها بطور آزمایشگاهی باویروسهای H5N1 عفونی شده اند . ما اخیراً شواهد ویروس شناسی وسرولوژیكی از عفونت زائی ویروس H5N1 در خوكها دراستان Fvjian بدست آوردیم .
با این حقیقت كه یكی از ویروسهایی كه در اینجا مورد مطالعه قر



نوع مطلب : عمومی، 
برچسب ها :

چهارشنبه 11 اردیبهشت 1387 :: نویسنده : حامد فرجی آیگانی


درباره وبلاگ

برای حمایت از ما روی تبلیغات كلیك كنید
مدیر وبلاگ : حامد فرجی آیگانی
نظرسنجی
نظر شما در مورد این وبسایت چیست ؟








برچسبها
جستجو

آمار وبلاگ
کل بازدید :
بازدید امروز :
بازدید دیروز :
بازدید این ماه :
بازدید ماه قبل :
تعداد نویسندگان :
تعداد کل پست ها :
آخرین بازدید :
آخرین بروز رسانی :
Dictionary of Animal Science
مرکز پروژه های دانشجویی ایران